Oligo DNA annealing and ligation
Aim
shRNAやgRNAの配列のサブクローニングなどに使えます。
Materials
準備 10 x Oligo アニーリングバッファー
100 mM Tris-HCl, pH 8.0
10 mM EDTA, pH 8.0
1 M NaCl
オリゴDNA Forward (乾燥品 or 200 uM DDWを注文する)
オリゴDNA Reverse (乾燥品 or 200 uM DDWを注文する)
Methods
ヒートブロックを95度に温めておく
乾燥品の場合、オリゴDNA Forward, Reverse を 200 uM になるようにDDWで溶かす。 よくVortexする。
以下の様にエッペンチューブに混ぜる
table: チューブA
200 uM OligoF 5ul
200 uM Oligo R 5ul
10x Oligo annealing B 2 ul
DDW 8 ul
Total 20 ul
混ぜたエッペンチューブを95度に温めたヒートブロックに入れて4分温める
ヒートブロックから外して、スピンダウンする
室温で冷えるまで待つ(10分くらい) この液は保存可能
このAnnealingしたOligo DNAを 1 x Oligo annealing buffer で 500 倍希釈する。
この液は保存不可能
500倍希釈したOligo DNA普通にライゲーションに用いる。Oligoのリン酸化は必要ない(Vectorがself ligationしない場合)。
table: Ligation
Insert (annealed oligo DNA) 1.5 uL
Vector 0.5 uL
2x Ligation High ver2 2.0 uL
Total 4.0 uL
16度、30分。
全量、Transformする。
コロニーをピックアップして、制限酵素チェック、シークエンス。
Remarks
かなりの割合でちゃんとLigationされている。
Oligoは50uM TE(いつも頼んでるやつ)でも変わらずうまくいきました。その場合、チューブAはDDWを入れずに、Oligoを9 ulずつ入れました。
2018-04-04後藤追記
Date : 2018-03-15
Modified Date :
Author : gmaryu.icon